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微生物檢測涉及多行業(yè)和領(lǐng)域，在實(shí)驗(yàn)室檢測中有著重要的地位，微生物檢測中的一些基礎(chǔ)操作還是需要必要的掌握。 接種 將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。 接種和分離工具 1.接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀 常用的接種方法有以下幾種： 1、劃線接種 這是常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。 2、三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。 3、穿刺接種 在保藏菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某菌具有鞭毛而能運(yùn)動，則在穿刺線周圍能夠生長。 穿刺接種的兩種方法：垂直法和水平法 4、澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45℃左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個的微生物菌落。 5、涂布接種 與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。 6、液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。 7、注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動物中，常見的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來預(yù)防某些病。 8、活體接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。 注：有所接種必須無菌操作 培養(yǎng)基經(jīng)高壓后，用經(jīng)過菌的工具(如接種針和吸管等)在無菌條件下接種含菌材料(如樣品、菌苔或菌懸液等)于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。 (1)接種消殺 (2)開啟棉塞 (3)管口消殺 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞。 分離純化 含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物(mixed culture)。如果在一個菌落中所有細(xì)胞均來自于一個親代細(xì)胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)(pureculture)。在進(jìn)行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。 1、傾注平板法 首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40-50℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。 2、涂布平板法 首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂專∫欢康南♂屢悍旁跓o菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。 3、平板劃線法 簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，在所劃的線上分散著單個細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個細(xì)胞長成一個菌落。 4、富集培養(yǎng)法 富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競爭，在生長能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。 5、厭氧法 在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無菌的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用n2或co2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分離某些菌，可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。 6、單細(xì)胞(或單孢子)分離法 是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細(xì)胞或單個個體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。較大的微生物，可采用毛細(xì)管提取單個個體。個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細(xì)胞或孢子以獲得純培養(yǎng)。單細(xì)胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求。 培養(yǎng) 1、根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。 好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)”。就是說這種微生物在培養(yǎng)時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實(shí)驗(yàn)室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。 厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。 2、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。 固質(zhì)培養(yǎng)：是將菌種接至疏松而富有營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，在合適的條件下進(jìn)行微生物培養(yǎng)的方法。 液體培養(yǎng)：在實(shí)驗(yàn)中，通過液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養(yǎng)物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。 常規(guī)鑒定技術(shù) (一)形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察 1、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)(包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進(jìn)行觀察，直觀地了解菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。 2、菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落(colony)。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。 (二)生理生化試驗(yàn) 微生物生化反應(yīng)：指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。 微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有： 1、糖酵解試驗(yàn) 不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗(yàn)。 2、淀粉水解試驗(yàn) 某些菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。 3、v-p試驗(yàn) 某些菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱v－p(+)反應(yīng)。 4、甲基紅(methyl red)試驗(yàn) 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基ph值下降至ph4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。 5、靛基質(zhì)(imdole)試驗(yàn) 某些菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。 6、硝酸鹽(nitrate)還原試驗(yàn) 有些菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾?。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。 7、明膠(gelatin)液化試驗(yàn) 有些菌具有明膠酶(亦稱類蛋白水解酶)，能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。 8、尿素酶(urease)試驗(yàn) 有些菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因?yàn)椴徽摰孜锬蛩厥欠翊嬖?，菌均能合成此酶。其活性ph為7.0。 9、氧化酶(oxidase)試驗(yàn) 氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素c氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素c再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 10、硫化氫(H2S)試驗(yàn) 有些菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。 11、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗(yàn) 本試驗(yàn)可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。 12、硫化氫-靛基質(zhì)-動力(sim)瓊脂試驗(yàn) 以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動力，然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對照。本試驗(yàn)用于腸桿菌科菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。 (三)化學(xué)成分分析 微生物保存 基本原理是在挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使其處于休眠狀態(tài)基礎(chǔ)上，人為地創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境，使其長期保存后仍能保持菌種原有的優(yōu)良特性?；敬胧┦堑蜏亍⒄婵?、干燥。 保藏方法： 1、定期移植法 亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，適合條件下培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于4～6℃進(jìn)行保存并間隔一定時間(3-6個月)進(jìn)行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。 2、液體石蠟法 指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，適合條件下培養(yǎng)好后注入消殺的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫(4～6℃)干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。 3、真空冷凍干燥法 指將保藏的菌種細(xì)胞或孢子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長期菌種保存方法。 4、-80℃低溫凍結(jié)法 將菌種懸浮于保護(hù)劑中，在－80℃冰箱中凍結(jié)保存的一種長期菌種保藏方法。 5、液氮超低溫凍結(jié)法 指懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于－196℃的液氮或－150℃左右的液氮?dú)庀嘀斜４娴囊环N長期菌種保藏方法。